Голландские исследователи объединили CRISPR и биолюминесценцию в экспериментальном тесте наинфекционные заболевания

По мнению исследователей из Нидерландов, недавно разработанный ночной белок может ускорить и упростить диагностику вирусных заболеваний.
Их исследование, опубликованное в среду в ACS Publications, описывает чувствительный одноэтапный метод быстрого анализа вирусных нуклеиновых кислот и их внешнего вида с использованием светящихся ярко-синих или зеленых белков.
Идентификация патогенов путем выявления отпечатков их нуклеиновых кислот является ключевой стратегией клинической диагностики, биомедицинских исследований, а также мониторинга безопасности пищевых продуктов и окружающей среды.Широко используемые количественные тесты полимеразной цепной реакции (ПЦР) обладают высокой чувствительностью, но требуют сложной подготовки проб или интерпретации результатов, что делает их непрактичными для некоторых учреждений здравоохранения или в условиях ограниченных ресурсов.
Эта группа из Нидерландов является результатом сотрудничества ученых из университетов и больниц с целью разработки быстрого, портативного и простого в использовании метода диагностики нуклеиновых кислот, который можно применять в различных условиях.
Они были вдохновлены вспышками светлячков, свечением светлячков и крошечными звездочками водного фитопланктона, и все это основано на явлении, называемом биолюминесценцией.Этот эффект свечения в темноте вызван химической реакцией с участием белка люциферазы.Ученые включили белки люциферазы в датчики, которые излучают свет, чтобы облегчить наблюдение при обнаружении цели.Хотя это делает эти датчики идеальными для обнаружения в местах оказания медицинской помощи, в настоящее время им не хватает высокой чувствительности, необходимой для клинических диагностических тестов.Хотя метод редактирования генов CRISPR может обеспечить такую ​​возможность, он требует многих шагов и дополнительного специализированного оборудования для обнаружения слабого сигнала, который может присутствовать в сложных, зашумленных образцах.
Исследователи нашли способ объединить белок, родственный CRISPR, с биолюминесцентным сигналом, который можно обнаружить с помощью простой цифровой камеры.Чтобы убедиться, что образца РНК или ДНК достаточно для анализа, исследователи провели амплификацию рекомбиназной полимеразы (RPA) — простой метод, который работает при постоянной температуре около 100°F.Они разработали новую платформу под названием Люминесцентный датчик нуклеиновой кислоты (LUNAS), в которой два белка CRISPR/Cas9 специфичны для разных смежных частей вирусного генома, каждый из которых имеет уникальный фрагмент люциферазы, прикрепленный к ним выше.
Когда присутствует специфический вирусный геном, который изучают исследователи, два белка CRISPR/Cas9 связываются с целевой последовательностью нуклеиновой кислоты;они становятся в непосредственной близости, позволяя интактному белку люциферазы формироваться и излучать синий свет в присутствии химического субстрата..Чтобы учесть субстрат, потребляемый в этом процессе, исследователи использовали контрольную реакцию, излучающую зеленый свет.Пробирка, меняющая цвет с зеленого на синий, указывает на положительный результат.
Исследователи протестировали свою платформу, разработав анализ RPA-LUNAS, который обнаруживаетРНК SARS-CoV-2без утомительного выделения РНК и продемонстрировал свою диагностическую эффективность на образцах мазков из носоглотки.COVID-19пациенты.RPA-LUNAS успешно обнаружил SARS-CoV-2 в течение 20 минут в образцах с вирусной нагрузкой РНК всего 200 копий/мкл.
Исследователи полагают, что их анализ может легко и эффективно обнаружить многие другие вирусы.«RPA-LUNAS привлекателен для тестирования на инфекционные заболевания в местах оказания медицинской помощи», — написали они.